Meest gestelde vragen Aardappelonderzoek
Onderstaande tekst geeft antwoord op de volgende vragen:
- Welke onderzoekmethode is voor mijn monster gebruikt?
- Wat is het verschil tussen ELISA en PCR?
- Wat is Elisa? Wat is PCR? Wat is immunofluorescentie microscopie (IF?)
- Wat is real-time PCR? Wat is multiplex PCR?
- Wat is de NAK BioPlex PCR voor ‘Erwinia’ soorten?
Voor de meest gestelde vragen over onderzoeksuitslagen klik hier. Staat uw vraag er niet bij dan kunt u gebruik maken van ons contactformulier. U ontvangt dan binnen twee werkdagen een reactie.
ELISA-methode
ELISA is een afkorting van enzyme-linked immunosorbent assay. De ELISA-methode is een zogenaamde serologische methode. Daarbij wordt gebruik gemaakt van het feit dat antilichaampjes, vaak geproduceerd door het immuunsysteem van zoogdieren, in veel gevallen specifiek reageren met micro-organismen (bacteriën, virussen etc.). Zo is het bijvoorbeeld mogelijk antilichaampjes te produceren die alleen met het aardappelvirus Y reageren, of alleen met het aardappelvirus A.
Tijdens de ELISA-test worden de micro-organismen uit plantensap gebonden aan de wand van putjes in een kunststofplaat. Specifieke antilichaampjes (bijvoorbeeld tegen het aardappelvirus Y), met daaraan gekoppeld een enzym, worden toegevoegd aan het putje in de plaat. Als het doelorganisme (hier: het aardappelvirus Y) aan de wand van het putje gebonden is, vindt er een reactie plaats van de antilichaampjes met het gebonden doelorganisme. In het hier beschreven geval vindt er alleen een reactie plaats wanneer er aardappelvirus Y in het putje is gebonden. Na wegwassen van de overbodige antilichaampjes (als er geen aardappelvirus Y aanwezig is, vindt er ook geen reactie plaats!) wordt er een kleurloze vloeistof aan het putje toegevoegd. Wanneer er een specifieke reactie (met aardappelvirus Y) heeft plaatsgevonden, zet het aan het antilichaampje gekoppelde enzym de kleurloze vloeistof om in een gekleurde vloeistof. Het doelorganisme (hier: aardappelvirus Y) is aangetoond!
Tijdens een serologische toets vindt de reactie vooral plaats met stofjes (eiwitten, polysachariden) uit de wand van het micro-organisme. Je kunt dus zeggen dat we bij een serologische methode vooral kijken naar de buitenkant (het omhulsel) van het micro-organisme.
De NAK hanteert verschillende varianten van de ELISA-methode. De methode wordt ondermeer ingezet voor het aantonen van aardappelvirussen in opgekweekte topogen van aardappelen tijdens het nacontroleonderzoek.
Immunofluorescentie microscopie (IF)
Net als bij de ELISA-methode maakt ook immunofluorescentie microscopie (IF) gebruik van specifieke antilichaampjes welke met eiwitten en polysachariden reageren die aan de buitenkant van het doelorganisme zitten. Ook IF is een serologische methode (zie ELISA)
Plantmateriaal (bijvoorbeeld naveluiteinden van aardappelen) wordt geschud in een buffervloeistof waarna een druppeltje van die vloeistof op een microscoopglaasje wordt gebracht. Na drogen wordt de inhoud van het druppeltje op het microscoopglaasje gefixeerd. Vervolgens worden er specifiek reagerende antilichaampjes toegevoegd met daaraan een stofje dat oplicht onder ultraviolet licht. Als het doelorganisme (bijvoorbeeld de bruinrotbacterie) niet aanwezig is, kun je die antilichaampjes weer van het microscoopglaasje afwassen. Wanneer het doelorganisme wel aanwezig is, binden de antilichaampjes zich aan het doelorganisme (hier: de bruinrotbacterie). Onder een microscoop – met toevoeging van ultraviolet licht – geeft het aan de antilichaampjes gekoppelde stofje fluorescerend licht af. Het hele doelorganisme licht, indien aanwezig, op onder de microscoop: we spreken van een positieve IF-reactie. Wanneer het doelorganisme (hier: de bruinrotbacterie) niet aanwezig is, ontstaat er geen fluorescentie want we hebben alle antilichaampjes met fluorescerende stofjes weggewassen: we spreken van een negatieve IF-reactie.
De IF-methode wordt door de NAK toegepast voor het aantonen van bruinrot- en ringrotbacteriën in aardappelen.
PCR
PCR is een afkorting van Polymerase Chain Reaction.
In bepaalde gevallen is het noodzakelijk of nuttig om geen serologische toets uit te voeren op specifieke stofjes (eiwitten, polysachariden) aan de buitenkant van het doelorganisme (bijvoorbeeld Elisa, immunofluorescentie microscopie IF), maar om te kijken naar de inhoud van het doelorganisme. In die gevallen gaan we op zoek naar stukjes specifiek, erfelijk materiaal (DNA, RNA), die karakteristiek zijn voor het organisme (bacterie, virus, schimmel, nematode) dat we willen aantonen. We spreken dan van een moleculaire toets. Hiervoor gebruiken we zogenaamde PCR-methoden. Deze minuscule stukjes DNA of RNA zijn zo klein dat ze niet aangetoond kunnen worden zonder ze eerst een groot aantal keren te kopiëren. Dit kopiëren gebeurt met behulp van de PCR-methode. Pas wanneer er voldoende kopieën aanwezig zijn, is het voor het doelorganisme specifieke stukje erfelijk materiaal zichtbaar te maken.
Het kopieerproces vindt plaats in een PCR-apparaat (thermocycler) waarin, bij verschillende temperaturen, toegevoegde bouwsteentjes erfelijk materiaal door een enzym samengevoegd worden tot kopieën van het origineel.
De NAK hanteert verschillende vormen van de PCR-methode. In sommige gevallen kunnen we de PCR-reactie rechtstreeks volgen: dan spreken we van real-time PCR. Waar we in hetzelfde plantensap, in één reactie, gelijktijdig meerdere doelorganismen kunnen aantonen, spreken we van een multiplex-PCR. De NAK BioPlex PCR voor ‘Erwinia‘ soorten is gelijktijdig een real-time PCR én een multiplex PCR.
PCR-toetsen worden toegepast waar dat voordelen heeft boven Elisa of IF, of waar Elisa en IF simpelweg niet kunnen. Met een PCR-toets op aardappelvirussen kan de tijd, benodigd voor een nacontroletoets, met 3-5 weken bekort worden: met PCR kun je rechtstreeks aan de knol toetsen, voor de Elisa-toets moet je eerst plantjes opkweken.
Ook zijn er doelorganismen die onvoldoende onderscheidende, specifieke eiwitten of polysachariden aan hun buitenkant hebben zitten om een serologische ELISA-toets of immunofluorescentie microscopie mogelijk te maken. Hier ben je dus verplicht naar het DNA of naar het RNA op zoek te gaan. Het toetsen op verschillende ‘Erwinia’ soorten met de NAK BioPlex-methode is daarvan een voorbeeld. De NAK gebruikt ook een multiplex-PCR voor het in één keer aantonen van verschillende soorten wortelknobbelaaltjes (Meloidogyne spp.) in grondmonsters.